メルマガ19号（2023年10月12日配信）

ゲノム編集サンプルの解析ソフトウェア開発状況

中前和恭1,2
1 広島大学ゲノム編集イノベーションセンター プラチナバイオ共同研究講座 バイオDX研究室
2 プラチナバイオ株式会社 研究開発部）

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ゲノム編集サンプルの解析ソフトウェア開発状況
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第3世代のゲノム編集ツールであるCRISPR-Cas9システムが登場して早十年が経とうとしている。その間、ゲノム編集技術は急速に進展し、現在では非常に多様なアプリケーションが登場するに至っている。それに伴いゲノム編集の解析を支援するためのバイオインフォマティクスツールも数々登場してきた。今回のメールマガジンにおいては、ゲノム編集のサンプルで利用される代表的なソフトウェアについて論じつつ、近年の研究動向についても触れたい。

まずゲノム編集サンプルの解析に関わるソフトウェアの中で代表的なものをカテゴライズするとすれば、 (1) TIDE解析ツール、(2) NGSによるアンプリコンシーケンス解析ツール、(3) ロングリードシーケンサーによるアンプリコンシーケンス解析ツール、(4) Genome-wideオフターゲット解析ツール、がある。それぞれについて項目に分けて述べたい。

(1) TIDE解析ツール

TIDE解析ツールはサンガーシーケンスのシーケンストレースデータを解析して、サンプルに含まれる変異種とその割合を推定するツールである。代表的なツールとしてTIDE [1]があり、他にもICE [2]やDECODR [3]がある。またTIDER [4]やICE [2]、DECODR [3]では特定の一塩基置換あるいは挿入の解析にも対応している。また、TIDE [1]は基本的にインデルの定量にフォーカスを置いているが、置換の割合にフォーカスした類似ツールとしてはEditR [5]というツールが存在している。このEditR [5]は元来Base Editingサンプルの解析を目的として作られたツールではあるが、非公式的にPrime Editingによる塩基置換解析でも利用例 [6–9]が報告されている。
TIDE [1]の基本的な利用方法についてはTogoTV [10]にて解説動画（https://doi.org/10.7875/togotv.2021.040）がアップロードされているため是非とも参照されたい。
TIDE [1]やICE [2]は、内部的にはシーケンストレースデータに対する統計的な計算（想定される複数のインデルのシーケンストレースデータを説明変数とした重回帰分析）を実施している関係で、2つ以上のインデル種が含まれるポピュレーション（Bulk)サンプルでも解析が可能である。その一方で、PolyPeakParser [11]やCRISP-ID [12]は、シーケンストレースデータのセカンドピークを読み取って2種類のアレル配列に分離することを行うため、クローニングした二倍体細胞をジェノタイピングする場合に適している。このように似たようなツールであっても対象サンプルや出現する変異種によって適不適があるため、各ツールの原著論文を参照して最適なものを検討することをお勧めしたい。

(2) NGSによるアンプリコンシーケンス解析ツール

NGSによるアンプリコンシーケンス（Deep sequencing）解析は、ゲノム編集標的で生じた変異アレルを高解像度に定量する手法として知られる。解析の方法としては、マッピングツールBWA-MEM [13]と変異検出ツールGenome Analysis ToolKit（GATK） [14]を用いた標準的なバイオインフォマティクス解析方法 [15,16]に加えて、CRISPResso2 [17]のようなゲノム編集を前提にしたインデルや置換の分類解析ができるツールで解析を行う場合もある。CRISPResso2 [17]は継続的にアップデートが行われており、現在はCRISPR-Cas9の解析のみならず、Base Editing [18,19]やPrime Editing [20]の解析も可能である。CRISPResso2 [17]は基本的にNGSのアンプリコンシーケンスデータ（.fastq）とアンプリコン配列情報、プロトスペーサー配列（認識配列）情報だけで解析ができるため、Cas12fやZF-DdCBEなどの新規ツールでの変異解析 [21,22]でも利用されることがある。そうした背景も相まってか、原著論文の引用数は400件を超えており、このカテゴリのグローバルスタンダードといって差し支えないだろう。ちなみに、CRISPResso2 [17]のリード分類結果をよく観察すると明白な誤分類に相当するようなデータも含まれていることがあるが、その場合はオプションの解析パラメータの最適化すると改善する場合がある。
アンプリコンシーケンス解析結果を考察する上では、セカンドオピニオンとしてCrispRVariants [23]やMaChIAto [24]などの別の解析ツールを使ってデータを解析してみるのも参考になるだろう。特にMaChIAto [24]は約100 bp程度のタグ配列のMMEJノックイン [25]やPrime Editing [20]による小規模変異導入の分類定量に特化しており、さらに効率とゲノムコンテキストとの関連性を定量することも可能となっている。
CRISPResso2 [17]以外のウェブツールとしては、AGEseq [26]、Cas-Analyzer [27]、CLiCKAR [28]、Outknocker [29]、Hi-TOM [30]、BE-Analyzer [31]、CRISPR-sub [32]、PE-Analyzer [33]、CRISPR-Analytics [34]などもある。ただウェブツールベースでの解析は簡便ではあるものの、容量制限や時間効率、最適化に利用可能な解析パラメータの選択肢の面でデメリットが多いため、よりハイスループットかつ正確に解析したい場合はUNIX/LINUXのコマンドライン上で解析するツール（CLIツール）の利用を推奨したい。このカテゴリのCLIツールの多くは数十GB程度メモリを搭載するPCで動作するようにデザインされていることが多いため、個人利用レベルのPCで気軽に利用が可能である。CLIツールとしては、CLI 版CRISPResso2 [17]、CrispRVariants [23]、MaChIAto [24]、ampliCan [35]、CRIS.py [36]、CRISPRpic [37]、ampliconDIVider [38]、SIQ [39]等々、ウェブツールよりも数多くのツールが公開されている。

(3)ロングリードシーケンサーによるアンプリコンシーケンス解析ツール

ロングリードシーケンサーについては、それ自体がトップジャーナルで目にしないことはないほど近年目覚ましい成果をあげている [40–42]。2023年9月現在、主に取り上げられるロングリードシーケンサーのリードには、中央値にして50–150  kbの長さのリードを約95%の精度で出力できるOxford Nanopore Technologies (ONT)社のONTリード [40,43,44]と、Circular Consensus Sequencing (CCS) を利用して18–25 kbの長さのリードを99.9%以上の精度で出力できるPacBio社のHiFiリードがある [40,45]*1。ゲノム編集においてもONTリードやHiFiリードを活用してアンプリコンシーケンス解析を行うツールが報告されている。
ONTリードに対応した解析ツールとしては、DAJIN [46]、CRISPRnano [47]、CRISPR-Analytics [34]、VAULT [48]、GREPore-seq [49]がある。DAJIN [46]はアンプリコンサンプルを解析して、Large rearrangementも含めた遺伝型解析をすることができる。正確な変異判別のために深層学習をアルゴリズム内に実装しており、これは他のツールには見られない特徴といえる。
また、HiFiリードに対応したツールとしてはKnock-Knock [50]やSIQ [39]がある。また、先述したCRISPR-Analytics [34]やVAULT [48]もHiFiリードに対応している。これらはこの数年以内に登場した解析ツールであり、今後も新しいロングリード対応型解析ツールが登場することが予想される。

(4) Genome-wideオフターゲット解析ツール

オフターゲット解析にも様々なものがあるが、ゲノムを対象とした解析に限って大別するとすれば、オフターゲットが予想されるゲノム領域に着目して、項目（2）（3）のツールを適用する解析と、ゲノム全体を対象としてシーケンスでオフターゲット領域をスクリーニング的に検出する解析（本稿では『Genome-wideオフターゲット解析）と呼ぶ）がある。このカテゴリでは後者に関連したソフトウェアについて述べる。
まずクローニングされた細胞や個体のゲノムでGenome-wideオフターゲット解析を行う場合はBWA-MEM等のマッピングツールと変異検出ツールGenome Analysis ToolKit（GATK）等を組み合わせた標準的なWhole Genome Sequencing（WGS）解析を適用している例がいくつか報告されている [16,51–53]。
一方で、ポピュレーション（Bulk）サンプルのオフターゲットを評価する場合では、NGSシーケンスライブラリ調製と解析ツール（スクリプト）に独自の工夫を施して低コスト検出または高感度検出を狙ったアプリケーションが利用されることが多い。例えば、培養細胞内でゲノム編集したゲノムを調べる場合は、BLESS [54]、IDLV [55]、GUIDE-seq [56]、BLISS [57]、CasKAS [58]などのアプリケーションが存在している。一方で、試験管上でオフターゲットを推定するCell-freeアプローチとしてはDigenome-seq [59]、DIG-seq [60]、SITE-seq [61]、CIRCLE-seq [62]、CHANGE-seq [63]、Extru-seq [64]が報告されている。in vivoサンプルのオフターゲット解析法はDISCOVER-Seq [65]、GUIDE-tag [66]が報告されている。他にも、意図しないChromosomal rearrangementをスクリーニングする方法としては、LAM-HTGTS [67]、CAST-Seq [68]がある。さらにABEに特化した方法としてEndoV-seq [69]があり、Prime Editingに適用可能な手法としては、nDigenome-seq [70]、PEACSeq [71]、TAPE-seq [72]、CROss-seq [73]が報告されている。これらほとんどの手法ではショートリードNGSのためのライブラリ調製を行う必要がある。一方で、ロングリードであるONTリードやHiFiリード用のライブラリ調製を想定したものには、SMRT-OTS [74]、Nano-OTS [74]、InSiDeR [75]などがある。今後はロングリードを想定した手法も続々と登場していくものと考えられる。
またゲノムDNAを直接調べるのではなく、RNA-seqデータから得たトランスクリプトーム情報からゲノム上のDNAオフターゲットの痕跡を調べるアプローチとしてCRISPRroots [76]が報告されている。当然ながら、このアプローチでは発現遺伝子領域しか調べることができないが、簡易的なオフターゲット推定方法にはなりうる。さらに、このアプローチをより発展させて、トランスクリプトーム上に表出しているオフターゲットの痕跡からオフターゲットが表現型へ与えうる影響を遺伝子オントロジー（GO）レベルで推定するDANGER analysis [77]を当グループでは報告している。

なお本稿では取り上げなかったが、MAGeCK [79]、CERES [80]、PASTMUS [81]などのCRISPR screen解析ツールや、GESTALT [82]、FRACTAL [83]、BAR-Seq [84]などのTracing関連ツールも数多く存在している。さらに、解析に限定しない様々なゲノム編集関連ツールに関しては、過去に総論 [85]にて解説をまとめ、ウェブページ『Genome Editing Software Guide』（https://geditingsoftware.github.io）上にリストとして公開している（2023年9月現在、422点収録）。
本稿で紹介したゲノム編集サンプルの解析ソフトウェアの多くはヒトの培養細胞やマウスで評価されているものがかなり多く、それと比較すると他の生物種への適用例はまだ限定的である。その一方で、ゲノム編集研究メタデータベースGEM [78]よって機械的に収集された研究エントリーを参照すると、バクテリアやウイルスを除くCRISPR-Cas9関連研究の全35,937件のうち、ヒトやマウス以外の生物種811種のエントリーは9,528件（全体の約27%）となっている。もちろん総論的な内容の研究論文もこの中に含まれうるので厳密な数ではないが、他生物への応用が約十年間でかなり広がっているのは間違いないだろう。様々な生物種に対して、解析ソフトウェアがどのようにカバーしていくかも今後注目していきたい。

*1：両者の出力リードの長さや精度については、使用プロトコールや試薬、環境条件によって変動する可能性があるのであくまで一例としてご理解いただきたい。

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